NANOG/乳腺癌缺失基因1通路对胃癌细胞生物学行为的影响

摘要：目的 研究NANOG/乳腺癌缺失基因1(DBC1)通路对胃癌细胞生物学行为的影响.方法 选取2014年5月至2015年5月接受胃癌切除术的25例患者.利用RT-PCR和蛋白质印迹法检测NANOG和DBC1在人畸胎瘤细胞N-tera、胃癌SGC-7901、HGC-27、MKN-45、MGC803、NCI-N87、BGC823细胞株、正常胃黏膜上皮细胞GES-1和胃癌组织中的表达.通过MTT实验、流式细胞术、平板克隆实验检测干扰NANOG-1组、干扰NANOG2组、干扰对照组和干扰DBC1组MKN-45细胞的增殖、凋亡与集落形成能力.取干扰NANOG组、干扰对照组、干扰DBC1组和干扰DBC1+NANOG组MKN-45细胞株,行PCR实验以验证两种基因的表达影响,进一步验证下调DBC1对细胞生物学行为的影响.基因芯片筛查干扰后的基因表达谱差异并进行生物信息学分析.双荧光素酶报告基因系统检测NANOG调控DBC1的作用机制.两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析.结果 NANOG和NANOGmRNA在N-tera细胞株中高表达,分别为1.02±0.08和0.95±0.03,在胃癌SGC-7901、HGC-27、MKN-45、NCI-N87细胞株中的表达分别为0.67±0.03和0.64±0.04,0.58±0.02和0.28±0.02,0.83±0.03和1.04±0.05,0.61±0.02和0.64±0.08,正常胃黏膜上皮细胞GES-1中未见表达,其在胃癌细胞株MKN-45中表达高(F=21.51、85.53,P均＜0.01).DBC1在HGC-27、MGC803、NCI-N87、SGC-7901、BGC823、MKN-45细胞株中的表达分别为0.37±0.02、0.33±0.02、0.42±0.01、0.58±0.04、0.33±0.05、0.87±0.02,正常胃黏膜上皮细胞GEs-1中均未见NANOG、NANOGmRNA和DBC1表达.24.0％(6/25)的患者胃癌组织中检测到NANOGmRNA和DBC1表达.与干扰对照组比较,干扰NANOG-1组、干扰NANOG-2组的细胞凋亡率增加[(2.24±0.17)％比(6.03±0.24)％、(6.95土0.38)％],差异有统计学意义(F=81.18,P＜0.01).与干扰对照组比较,干扰NANOG-1组、干扰NANOG-2组细胞集落形成能力明显下降(172.03±6.35比74.32±5.32、53.08±3.82),差异有统计学意义(F=177.61,P＜0.01).PCR验证实验显示,与干扰对照组比较,干扰NANOG组细胞中NANOGmRNA和DBC1 mRNA水平均较低(1.04土0.05比0.54±0.03和1.08土0.08比0.42±0.03),干扰DBC1组DBC1 mRNA水平较低(1.08±0.08比0.50±0.04),差异均有统计学意义(t=9.15、7.37、6.06,P均＜0.01);干扰DBC1+NANOG组NANOG mRNA水平较高(1.04土0.05比3.01±0.08),但DBC1 mRNA水平较低(1.08±0.08比0.71±0.06),差异均有统计学意义(t=-20.22、3.74,P均＜0.05);干扰DBC1+NANOG组DBC1 mRNA水平高于干扰DBC1组(0.71±0.06比0.50±0.04),差异有统计学意义(t=4.00,P＜0.05).生物信息学分析DBC1基因启动子区域有NANOG蛋白质的可能结合位点.双荧光素酶报告系统显示,NANOG蛋白质对DBC1基因启动子区存在转录激活作用.结论 NANOG、DBC1在多种胃癌细胞中高表达,NANOG可通过调控DBC1的表达影响MKN-45细胞的增殖、凋亡、集落形成能力,NANOG/DBC1通路有望成为胃癌治疗的新靶点.